En 1928, más precisamente en septiembre, Fleming descubre por casualidad los efectos de la penicilina, en el hospital St. Mary de Londres, en cuyo laboratorio cultivaba capas de estafilococos para vacunas. Fleming descubrió la penicilina por casualidad, cuando observaba que una colonia extraña se había formado en una de las bandejas de cultivo, y descubrió que el agente era un moho proveniente de una espora que se había depositado en el caldo. En experimentos posteriores este descubrió que este hongo inhibía el crecimiento de las colonias de estafilococos, las pruebas le confirmaron también que el hongo producía la correspondiente sustancia activa.
El 7 de marzo de 1928 Fleming usa por primera vez el término penicilina, antes nombrada como jugo de moho. El 10 de mayo, presenta al British Journal of experimental Pathology su primer informe sobre esta; por lo visto era más que consciente de la importancia y consecuencias de su descubrimiento para tratar las infecciones bacterianas. Destaca que la penicilina era eficaz sobre todo contras las bacterias generadoras de bacilos de difteria y pus; pero ni el ni sus colaboradores lograron aislar esta sustancia para crear la base de los medicamentos.
Tuvo que pasar una década hasta que un grupo de bacteriólogos dirigidos por Howard Florey, desarrolló nuevos métodos de producción masiva. El medicamente se probó exitosamente en Oxford en 1941; a su vez viajaron a Estados Unidos para colaborar en el desarrollo de la producción farmacéutica. La industria mencionada en este país, se interesó cada vez más por la penicilina, durante la Segunda Guerra Mundial era considerada un medicamento importante para curar a soldados heridos o afectados a infecciones.
El desarrollo de la misma en producción masiva se acelera con la entrada de este país en la contienda en diciembre de 1941; al principio solo se distribuyó en las fuerzas armadas, y solo a partir de 1945 estuvo disposición también de los civiles.